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2024年10月9日

前回紹介した論文に引き続き、Cellに掲載された論文で、デンマークの２つの研究グループと都医学研の正井久雄さんの研究グループが共同で行った研究結果である。読んでみると、前の論文より分かりやすいので、こちらを先に紹介すべきであった。重複するところもあるが、そのまま紹介する。

文献19：Charlton, S. J. et al. Cell 187: 5029-5047 (2024)

The fork protection complex promotes partial histone recycling and epigenetic memory

Replisomeの構造的解析によれば、Mrc1 (ヒトではCLASPIN), Tof1（ヒトではTimeless; fission yeastではSwi1）, Csm3（ヒトではTipin、fission yeastではSwi3）よりなるfork protection complex (FPC) がreplication forksを安定化させている（図１）。Fission yeast FPC mutantsはheterochromatin欠損変異（centromeres, telomeres, mating-type regionなどの異常）として得られた。Replisome はnucleosome assembly factors, histone modification enzymesやrecycling of modified parental histonesのrecruitを仲介しており、parental and newly synthesized histonesの子細胞のDNA鎖への配分も支配している。著者たちは、fission yeastのgeneticsとゲノム解析によって、epigenetic inheritanceにおけるFPCの役割を解明しようとした。

Heterochromatin (HC)の維持にはFPCが必要である。

Fission yeastのmating type regionのHCを実験系として使った。cenH elementのHCをRNAiによって樹立し、Atf1-binding sitesからdomain boundaries IR-Lまで全領域に拡張させた。一度HCは構築されると、数百回の細胞分裂にわたって、RNAiとcenHの関与なしに維持された（図２）。HC樹立はcenHに隣接する部位に挿入したYFP発現変化で調べ、HCの拡張は縁側に挿入したmCherryの発現変化でモニターした。

　Clr4Δ細胞（H3K9me HCを欠損する）にclr4 geneを導入することで、de novo HC formationのrateを測定した。HC形成にそれぞれswi1Δ, swi3Δ, mrc1Δがどう影響するかを見た（図３）。その結果、FPCの欠損はHC構築形成には必要がないことが示された。同時に、FPCに欠損がある場合、継代25代程度続けると、HCは完璧には維持されなかった。Clonalな培養によって、mCherryの発現抑制（HCの維持）が、二つの娘細胞の一つで、壊れる場合が観察された（HCのasymmetric伝達）。

Mrc1のHC維持の機能はcheckpointにおける役割とは異なる

図４のMrc1のdomain構成を参照のこと。Mrc1Δ、ΔHBS (Hsk-bypass segment)、ΔNTHBSはどれもsilencingに欠損を示した（図５B,C）。HBS mutantsはcheckpoint機能があったが、NTHBS mutantsは欠損していた（図５D）.したがって、Mrc1のHBS domainがHC維持機能の鍵となっている。さらに、Mrc1とHsk1はどちらもHC gene silencingで互いに独立に機能している、データが示されている。

HC維持におけるMrc1とMcm2の共同作業

図６Aに示したように、pombeとcerevisiaeは共に、Mrc1 HBSにDDDSDDED (795-801)およびKAF (833-835)配列を有している。これらの配列をAに改変したところ、silencingに欠損を生じたが、checkpoint機能には影響しなかった。Cross-linking mass spectrometry or cryo-EMの結果から推定したreplisome factorsとcerevisiae Mrc1のcontact pointsは、pombe Mrc1にもあるNTHBSあるいはHBS domainsで、Mcm2とcontactしていた（図６A）。仮に、Mcm2 amino-terminal HBDがparental histone recyclingに関わっているとすれば、Mrc1との共同作業が考えられる。PombeのMcm2 HBDのY80 and Y89（他の主でBHに必要とわかっている）をAに痴漢したmutantを作った。Mcm2-2A mutantでは、mCherry reporterの抑制がなくなった（図６B）。このsilencingの消失はmrc1 mutantsと同じ性質を示した。これらの結果から、Mrc1とMcm2は共同でHC維持に作用していることが示唆された。

　Mrc1ΔHBSとmcm2-2Aはsub-telomeric regionsのH3K9me2を消失させたが、RNAi activityの部位のH3K9me2はそのままだった（図６C）。このことは、HC構築を支える強いシグナルがMrc1の作用の他にあることを想像させる。そこで、HCのcenH RNAi nucleation siteのdeletionを作っても、HCは壊れなかった。しかし、mrc1ΔHBSを欠損させると、H3K9me2の部分的欠損が現れた。したがって、Mrc1とmcm2 double mutantでH3K9me2が残ったのは、ΔK部位にsilencing elemtntsが残っていたのかもしれない。

　Mrc1のHBSがhistone recyclingで機能しているとすると、Mrc1ΔHBSにGFPをfuseさせ、そこにPob3-GBPを加えて、HBS欠損を補えるかどうかを見た（図７左）。結果は、silencing欠損がある程度補償された（図７右）.これらの結果は、Mrc1 HBSがreplication forkにおけるhistone chaperone activityを提供していることを示唆する。

Parental histonesのlagging strandへのrecycling

DNAが複製したとき、parental histonesとnew histonesがleading and lagging strandsにどう分配されるかを調べた。H3K36me3をparental histonesの印とし、H4K20me0をnew histonesの印とした。Fission yeastでは、cell cycle M-phaseのすぐ後にS-phaseが始まるので、cold-sensitive tubulin mutantを使い、S-phase開始に同調させておき、さらにそのとき、合成されたDNAはEdUでラベルした。histone markersでparental histoneとnew histoneがそれぞれ結合しているDNA断片を取り分けた。さらに、DNA２本鎖を分けて、EdUを含むDNA鎖を分別し、sequencingを行った（図８）。S-phaseのDNA合成開始点はsequencingの結果から同定できる。

　図９に示したように、WTでは、parental histoneのleading strandとlagging strandへの結合はsymmetricalであるが、mrc1ΔBSやmcm2-2Aの変異株では、leading strandに偏っていた。当然、new histoneは逆になった。結論として、Mrc1はMcm2と同様に、parental histonesをlagging strandに振り分ける働きをして、WTにおけるhistones分配のバランスをとっている。

構造的観点からみたMrc1のhistone recyclingでの役割

Mrc1は、場合によってはMcm2と共に、histonesに結合し、他の多くの因子と共同でhistoneのco-chaperoning機能を発揮しているであろう。既に、FACTとAsf1は、replisome componentsのMCM2やPolαと共に、histone co-chaperoningを行っていることが報告されている。これらのことから、soluble chaperonesがhistonesを、replisome中をhistone-binding interfacesをたどって、しかるべき部位に運ぶと考えられる。AlphaFold構造予測によれば、Mrc1は単独、あるいはMcm2と共に、nucleosome中と同じ構造をとっているH3-H4 tetramerに結合する。Mrc1の710-790（HBSの先の部分を含む：図10参照）の部分がH3-H4 dimerを包み込み、長いα-helixをbridgeとしてもう一つのH3-H4とつながっている（図10A）。この結合様式は、結晶構造解析によって示された、mammalian Mcm2がH3-H4を包み込む様式と同じである。

　Mrc1 HBSはMrc1 HBDとMcm2の連結を担っている（KAF motifがMcm2のF204、L208などが形成するhydrophobic grooveに接している（図10A）。DSE motifは両者のflexible connective linkerとして機能している（図10i）。これらのHBSが両者の連結にかかわる構造は、XL-MSやcryo-EMのデータと一致している。H3-H4側からみると、HBSのR784からの配列にH4のC-terminusやdimer中のH3のL1-linkerなどに接している（図10ii）。

Pull-down assayで検証したMrc1とH3-H4の結合

Full-length Mrc1と、HBDは有するがMrc1 binding siteを欠損したMcm2によるpull-down assayを行った（図11）。H3-H4が存在するときにのみ、Mrc1はMcm2 mutant共沈した。すなわち、Mrc1とMcm2 mutantは独立に、しかも同時にH3-H4に結合する。また、Mrc1はH3-H4 dimerよりも、ずっと強くcross-linked H3-H4 tetramerに結合した。図10Bにある、RKRN residueおよびMFL residueは、それぞれlong Mrc1 helixをtwo H3-H4 dimersに結合が予測されたが、それぞれの残基をAlanineに置換したmutantsでは、実際にin vitro H3-H4 dime bindingが弱かった。それらのmutantsは細胞レベルでみた、silencing効果も弱かった（図12）。RKRN mutantでは、parental histonesのleading strandへの振り分けが強くみられた（図13）。しかし、MFL mutantでは、逆に、lagging strandへのparental histonesのほうが優先された（図13）。すなわち、Mrc1はparental histonesのleading and lagging strandの両方で機能している（ただし、後者ではMcm2と共同で）。これらのMrc1の分子機能は、conserved MRC1-like domainのHBD、HBS connectorおよびMcm2-binding regionsにある。